인하대학교  2010 년도 학위논문

고 처리 용량 단백질 A 공정용 컬럼 순환 연속 주입식 크로마토그래피 개발
Development of Continuous Feed Chromatography using Switching Column(CFCSC) System for High Throughput Protein A Process

전수희

인하대학교 인하대학교 대학원 해양과학생물공학과

2010 석사 학위논문

   단백질-A(Protein-A) 크로마토그래피는 단백질-A가 세포 배양액 안에 들어 있는 단일클론 항체에 매우 높은 특이적 친화력을 갖고 있기 때문에 단일클론 항체 정제에 매우 강력한 도구가 되어 왔으나 최근 세포 배양액의 단위 역가가 급격히 상승하고 추세여서 정제 공정의 병목(bottle neck)이 되고 있다. 기존의 단백질-A 크로마토그래피는 레진 값이 매우 비싸기 때문에 한 회분(Batch)의 세포 배양액을 정제하는 데 있어서 큰 단일 컬럼을 사용하여 단 한 번에 정제하기 보다는 작은 단일 컬럼을 여러 회 사용하여 정제하는 식이다. 결과적으로 단백질-A 공정의 처리 용량은 다른 크로마토그래피 보다 상당히 낮은 편이고 다른 단점으로는 소위 역동적 흡착 능력(Dynamic Binding Capacity)과 상업 생산 규모에서 컬럼 팩킹의 제한 때문에 레진의 사용 효율이 낮다는 것이다. 최근에 기존의 회분식 단백질-A 공정을 개선하고자 단백질-A 공정용 모사 이동상 크로마토그래피 (Simulated Moving Bed Chromatography)가 개발되었지만 실질적인 바이오 의약품 생산 기준 및 규제 관련 문제, 예를 들면 회분(batch) 구분 또는 짧은 생산 기간 사이의 제품간 교체 작업 등의 문제들로 인해 실제 항체 또는 항체 융합 단백질 제품 정제 공정에 적용되고 있지는 않다. 본 연구에서는 세포 배양액으로 부터 단일클론 항체를 연속적으로 정제하기 위해 두 컬럼 또는 세 컬럼 순환 식 연속 주입 크로마토그래피(CFCSC)를 설계하여 공개된 논문과 상업 생산 데이터에 근거하여 계산함으로써 이 시스템들의 효율성과 경제적 효과를 예측하였다. 두 컬럼 CFCSC는 낮은 역가의 세포 배양액 정제를 위해 설계되었다. 주입 단계(load phase)에서 세포 배양액은 첫 번째 컬럼에 주입되고 첫 컬럼으로 부터 break through가 나오기 시작하면 두 번째 컬럼에 직렬로 연결되어 주입이 계속 이루어 진다. 일단 첫 번째 컬럼이 목적 단백질을 최대로 흡착하면 그 컬럼은 두 번째 컬럼으로 부터 분리되어 회수 및 재생 단계(recovery and regeneration)로 들어 가고 동시에 두 번째 컬럼으로는 주입이 계속 이루어 진다. 첫 번째 컬럼의 재생이 완료되면 두 번째 컬럼에 직렬로 연결되어 두 번째 컬럼으로 부터 나오는 break through가 첫 번째 컬럼에 주입되고 두 번째 컬럼이 최대로 흡착하게 되면 컬럼이 분리가 되어 두 번째 컬럼은 회수 및 재생 단계로 들어 가고 첫 번째 컬럼은 계속 주입이 이루어 진다. 세포 배양액 저장 탱크 내의 배양액이 고갈 될 때까지 컬럼이 순환하면서 공정은 계속 진행된다. 세 컬럼 CFCSC는 두 컬럼 CFCSC의 확장된 버젼이며 높은 역가의 세포 배양액 정제를 위해 개발 되었다. 계산 결과, 두 컬럼 CFCSC는 최대 흡착 능력까지 레진을 활용함에 기인하여 바리오리엑터 역가 1.0 G/L에서 10.0 g/L의 범위에서 회분당 공정 시간을 동등하거나 짧게 하면서 30%에서 50%의 컬럼 운전 횟수 감소 및 동일 비율의 레진 사용량 감소를 예상할 수 있었다. 세 컬럼 CFCSC는 최대 흡착 능력까지 레진을 활용함에 기인하여 바리오리엑터 역가 3.0 g/L에서 10.0 g/L의 범위에서 회분당 공정 시간을 동등하거나 짧게 하면서 30%에서 50%의 컬럼 운전 횟수 감소 및 동일 비율의 레진 사용량 감소를 예상할 수 있었다. 결론적으로, CFCSC 시스템은 고 역가 세포 배양액 회분을 고 처리 용량 및 고 효율로 정제해야 하는 수요를 충족시키는 대안적인 크로마토그래피 시스템이 될 수 있다.

   Protein A chromatography has been the most powerful hard working horse for monoclonal antibody purification because it has very specific affinity to the monoclonal antibody in cell culture fluid and it became a bottle neck in the downstream process due to recent high cell culture fluid titer increase trend in the upstream. Conventional Protein A chromatography process is a single small column multiple cycle batch chromatography operation to purify a batch of cell culture fluid rather than a single big column single cycle batch chromatography operation because of the very expensive resin cost. As a result, the throughput of Protein A process is relatively quit low compared to other chromatography process. Another draw back of the conventional batch chromatography for Protein A process is low resin usage rate due to so-called dynamic binding capacity and column packing restriction in industrial scale. Recently, the Simulated Moving Bed(SMB) chromatography for Protein A process was developed to improve the conventional batch chromatography for Protein A process. However, the application of the SMB-technique to the downstream processing of antibody products or fusion protein products is few because there are several challenges to be resolved in the light of practical biopharmaceutical standard and regulatory affair aspects, for example, batch separation issue or product change over issue between short production campaign. In this study, the chromatography with Continuous Feed using Switching Column (CFCSC) system for protein A process was designed with two or three column configuration in switching mode to purify monoclonal antibody from cell culture fluid continuously and the expected efficiency and economic effect of these systems with calculation were verified with calculation using data based on the published article and industrial practice. The two column CFCSC was designed for the low titer cell culture fluid process. In the loading phase, the clarified cell culture fluid is loaded and the breakthrough from the first column is load to the second column subsequently. Once the first column captures the product to the maximum, the column is disconnected from the second column and go through the recovery and regeneration phase. imultaneously, the cell culture fluid is loaded to the second column to the maximum capacity. The switching will occur in turn and continues until the cell culture fluid is exhausted. During the recovery and regeneration phase, the product is recovered and the column is regenerated for next cycle. The three column CFCSC is the extended version of two column CFCSC and was designed for the high titer cell culture fluid process. From the calculation, the two column CFCSC showed 30% to 50% cycle reduction and Resin usage reduction due to maximized binding capacity without compromising process time per batch in the bioreactor titer range of 1.0 g/L to 10.0 g/L. The 3 column CFCSC showed 30% to 50% cycle reduction and Resin usage reduction due to maximized binding capacity without compromising process time per batch in the bioreactor titer range of 3.0 g/L to 10.0 g/L. In conclusion, the CFCSC system can be an alternative chromatography system to meet high through-put high efficiency demands in the high cell culture titer batch production.